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          科研進展:復旦大學揭示神經幹細胞不對稱分裂的相分離調控機制

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            細胞極性是大部分細胞都具有的基本歐美日韓在線旡碼免費視頻性質,具體表現為細胞形態的不對稱性以及胞內細胞器、蛋白質及核酸等組分的不對稱分佈,對於細胞的分化、發育與功能發揮起著舉足輕重的作用,其破壞與發育缺陷、腫瘤生成及轉移密切相關。無論是神經元、上皮細胞中長期維持的極性,還是細胞分化、遷移過程中涉及的瞬時極性,細胞極化的共性,是一些極性調控蛋白質被特異地招募到指定膜區域,並發生顯著的局部聚集。值得註意的是,這些蛋白質(如Par3/Par6/aPKC,Frizzled/Dishevelled/Diego復合物等)往往通過相互作用自發形成高度聚集的塊狀或點狀結構,附著於細胞質膜內表面,並可快速地響應細胞信號發生去組裝。然而這些蛋白復合物如何能在開放接觸胞質的前提上實現極性聚集,同時又保持高度的動態性,尚待研究解答。

            近年來,生物大分子的“液-液相分離”(liquid-liquid phase separation, LLPS)被證明是細胞內多種沒有脂膜包被的無膜細胞器的重要形成機理。極性復合物聚集體也具有這些無膜細胞器的類似特征,如高度凝聚性、動態性等。復旦大學生物醫學研究院溫文玉課題組與新加坡國立大學淡馬錫生命科學研究院蔡毓課題組前期已經證實,在果蠅神經幹細胞(Neuroblast)不對稱分裂過程中,細胞命運決定因子Numb和連接蛋白Pon之間多位點結合導致的液-液相分離介導瞭Numb在神經幹細胞底端皮層的極性富集,進而調控瞭神經幹細胞的分化。

            近期,溫文玉組和蔡毓組再次合作,研究發現神經幹細胞不對稱分裂過程中,Par蛋白復合物(Par3/Par6/aPKC)也是通過相分離的方式進行組裝,進而調控頂-底細胞極性軸的建立以及神經元的分化。研究者進一步提出,極性蛋白復合物多價相互作用介導的液-液相分離可能是細胞極性建立的普遍機制。5月8日,相關研究成果以《相分離介導的Par復合物聚集體形成》(“Par complex cluster formation mediated by phase separation”)為題在線發表於《自然-通訊》(Nature Communications)。

            作為最早被報道的極性調控復合物,高度保守的Par復合物由Par3(果蠅中為Bazooka),Par6和aPKC組成,三者可以兩兩相互結合形成一個極性核心,並進一步招募其他蛋白發揮功能。以果蠅神經幹細胞的不對稱分裂過程為例,在細胞分裂開始時,均勻分佈的Baz/Par6/aPKC逐漸聚集在細胞的頂端皮層,而細胞命運決定因子及其銜接蛋白(包括Numb/Pon復合物)在aPKC磷酸化的調控下,脫離頂端皮層,進而在細胞底端聚集最新更新國產區 ,從而建立瞭頂-底端極性。極性分佈於細胞兩端的蛋白質及RNA隨即被不均一地分離到兩個子細胞中,從而使其具有不同的命運。細胞分裂完成後,細胞兩端的蛋白聚集體去組裝以進行下一輪的循環。在這項最新工作中,研究者發現Par復合物隨著細胞周期,以液滴的形式凝聚於頂部皮層上。進一步體外及細胞內過表達實驗表明,Par3由於其NTD結構域的寡聚可發生液液相分離現象,Par6通過其C末端氨基酸與Par3 PDZ3的特異結合而被富集到Par3凝聚體中,同時極大地促進瞭Par3的相分離能力。

            作為復合物中唯一的激酶,aPKC也可以被招募並富集在Par3/Par6凝聚體中,但是凝聚體中的aPKC處於非活性狀態。重要的是,激活的aPKC可以磷酸化Par3,並促使Par凝聚體解離。研究者推測,Par凝聚相液滴的形成可能是將胞質中有限的aPKC轉人體攝影藝術運至局部膜區域的一種有效方式。在到達特定膜區域後,aPKC可在其他調節因子(如Cdc42)的作用下激活,進而通過磷酸化Par3使得Par復合物凝聚體解聚;同時,激活的aPKC可發揮其激酶活性以介導細胞命運決定因子的底部定位。幹擾Par3/Par6液液相分離的形成會破壞果蠅神經幹細胞不對稱分裂過程中頂-底端極性的建立,進而導致神經元譜系發育的缺陷(圖1)。結合前期工作,該研究表明極性蛋白復合物多價相互作用介導的液液相分離可能是細胞極性建立的普遍機制。

            盡管液-液相分離為細胞中大量無膜細胞器的形成、以及多種生理過程中細胞組分的選擇性濃縮和分離機制提供瞭一個全新的視角,其在生理條件下是否真正調控這些生物學過程一直是爭論的焦點。畢竟相分離體現出極大的蛋白濃度依賴性,而在體外實驗與細胞內過表達體系中,目標蛋白的濃度可能遠大於生理濃度。為瞭解決這一問題,研究者通過設計GFP標簽的Baz敲入果蠅,探討瞭內源表達量條件下Par復合物相分離對於極性建立的調控。出乎意料的是,對於缺失NTD結構域、低相分離能力的Baz ΔNTD突變體,在轉基因果蠅的過表達體系中會造成>80%的神經幹細胞極性喪失;而在敲入果蠅中,絕大部分神經幹細胞裡的Par復合物都可觀察到頂部皮層的聚集,但伴隨有明顯的胞質擴散現象,進而造成發育後腦尺寸的減小。更重要的是,如果用無二級結構,但可發生相分離的FUS的LCD片段替換Baz NTD結構域,可以顯著挽救NTD缺失造成的腦發育異常(圖1)。這一結果為相分離介導的Par復合物極性分佈及極性建立提供瞭強有力的數據,同時也指出瞭過表達體系對於研究相分離生理意義的缺陷。

          圖1 Par復合物相分離調控神經幹細胞極性建立

            綜上所述,這項研究揭示瞭極性蛋白復合物Par3/Par6/aPKC通過多價相互作用引起的相分離促進瞭其在局部膜區域的凝聚,而相分離凝聚體對於細胞信號的快速反應也保證瞭極性建立與解除的高度動態性。由於大多極性復合物都具有類似的多位點結合模式,以及動態分佈規律,該研究提出的蛋白質相分離可能是調控細胞極性的普適性規律。

            復旦大學博士生劉子亨、碩士生顧愛紅,以及新加坡國立大學楊迎博士為論文共同第一作者,復旦大學研究員溫文玉和新加坡國立大學教授蔡毓為論文的共同通訊作者。該課題還得到瞭首都師范大學教授李周華、香港科技大學教授張明傑等的大力支持。